戊型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hepatitis E Virus(HEV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

戊型肝炎(Hepatitis E )是一種經(jīng)糞一口傳播的急性傳染病。HEV 是單股正鏈 RNA 病毒，呈球形、直徑 27~34nm 無(wú)囊膜，核衣殼呈二十面體立體對(duì)稱。戊型 肝炎病毒(HEV)為無(wú)包膜的球狀顆粒，分為 1~8 共 8 個(gè)基因型，中國(guó)內(nèi)地流行株 主要為 1 型(曾稱緬甸株)，其次為 4 型。目前尚不能對(duì) HEV 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，可實(shí) 驗(yàn)室感染獼猴等多種猴類，HEV 對(duì)外界環(huán)境抵抗力不強(qiáng)。戊型肝炎傳播途徑(主要 經(jīng)糞-口途徑傳播)和臨床表現(xiàn)(隱性感染及急性肝炎，不致慢性肝炎等)與甲型肝炎 相似。戊型肝炎在 15~39 歲的青年和成人高發(fā)。戊型肝炎亦為自限性疾病。HEV 對(duì)肝細(xì)胞亦無(wú)直接病變作用(CPE)。機(jī)體于病后可獲得一定的免疫力，但不夠穩(wěn)固。 目前無(wú)戊型肝炎疫苗，預(yù)防戊型肝炎采用切斷糞-口傳播途徑為主的措施。本產(chǎn)品 是基于染料法熒光定量 PCR 原理開發(fā)，專門檢測(cè)戊型肝炎病毒的試劑盒。它具有 下列特點(diǎn)：

1.一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2.根據(jù)戊型肝炎病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測(cè)，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

戊型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供RNA段作為陽(yáng)性對(duì)照。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣 品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。 二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照 梯度稀釋液中的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。

7. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。 

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

8. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照。 9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分： 

9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理 10. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于 或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等 于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。